Moleküler genetik araştırma yöntemi

keşfetmek ve DNA yapısı kullanılan moleküler genetik yöntemde varyantları tanımlamak için. kromozom, gen için veya alel bu bölgesinin araştırır her DNA bölgesi için, yöntemler farklıdır. Her bir moleküler genetik yöntemi temelinde bir kısmı ya da RNA ve DNA'nın diğer manipülasyon içerir. laboratuvar koşulları yürütülen edilemez olmadan tüm bu yöntemler, muazzam karmaşıklığı ile karakterizedir ve personel kalifiye olmalıdır. Bu çalışma birkaç aşamada gerçekleştirilir.

aşamaları

İlk olarak, RNA ya da DNA örnekleri üretilecek. Burada, moleküler genetik yöntem, hemen hemen herhangi bir malzemeye uygulanabilir: Kan, lökositlerin bir damla, kültür fibroblastlar, mukoza (kazınmış), hatta saç folikülleri, - DNA, bir numuneden elde edilebilir. Herhangi bir moleküler genetik yöntemler ve bunların çeşitli seçenekleri kullanım için uygundur ve uzun izole edilen DNA dondurulmuş olarak saklanır var. Bu (canlı organizmanın katılımı olmadan in vitro), canlı dokuda, polimeraz zincir reaksiyonu yardımcı olur, ikinci aşama, DNA'nın istenilen parçalarının (amplifikasyon) birikimi adanmıştır. Bunun bir sonucu olarak, bu zincir reaksiyonu ile seçilen DNA fragmanı çarpar, ve DNA artar kez anlamıyla milyonlarca miktarı.

Moleküler genetik araştırma yöntemleri üçüncü adım çarpılan bir DNA kısıtlama (bu parçalanma, yırtılma ya da kesme) varsayılır. Kısıtlama poliakrilamid ya da agaroz jeli üzerinde elektroforez ile gerçekleştirilir. DNA fragmanı okuyan bu moleküler genetik yöntem herkes jel belirli bir konum almaya olanak vermektedir. Bundan sonra, jelin etidyum bromür ile muamele edilir, DNA'ya bağlanma yeteneğine sahip, ultraviyole ışık ile ışınlama ve ardından da lüminesans bölümlerini görmek mümkündür. Moleküler genetik tanı yöntemleri çeşitli ve çoktur, fakat ilk iki adım tüm ortaktır. Ancak DNA fragmanlarının belirlenmesi için, jel diğer mevcut yöntemler, renkli birçok edilebilir.

tür

tespit mikobakteri için en doğrudan ve yaygın yöntemler yukarıda moleküler genetik DNA, öğrenme yöntemi içerebilir. Özünde, yani patojen spesifik DNA fragmanlarının tarama zincir malzemesinin tespit edilmesi için. Moleküler genetik tanı yöntemleri henüz tüberküloz gibi hastalıklara tanımak için daha etkili bir yol yoktur. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) kullanarak, orijinal DNA yani, bir milyon kat kopya sayısını artıracaktır amplifikasyon olacaktır ve bu sonuçları gösterir emin olabilir. Bu yöntemin en önemli avantajı, yüzde doksan beşi, daha - hassasiyet seviyesi çok yüksektir.

Bu durumda çekme örnek, belirli bir oligonükleotit sekansı Yüzaltı kat artmıştır göstermesi verim birden çok kopya etkinliği üzerine araştırmaların moleküler genetik yöntemler geri kalanı anlamıyla, iki katına çıktı. Solunum sisteminin tüberküloz bile kültür tanı önemli hassasiyetini düşürmek. Modern tıp tüberküloz tanısı moleküler genetik yöntemlerle dayanmaktadır nedeni budur. Bir tarif edilen yöntem olup, yüksek antijenik değişkenliğinden patojenlerine ile ilgili diğer bir şekilde tespit özellikle çok daha zordur etkilidir - özel gerektirir besleyici ortam ve uzun bir süre kültive. Biyokimyasal ve moleküler genetik yöntemler, sonuç üzerinde çok farklı bir etki oluşturur.

Tüberküloz tanısı

tüberküloz Marshall PCR teşhisi en çok hastalığın tüm dört tip özel olan DNA dizilerini kullanarak. bu elemanlar, göçmen veya Mycobacterium tuberculosis ve her zaman genomunda bulunan birden fazla kopyasını karakterize Bu amaca ulaşmak için genellikle, dizi elemanlarının (IS-986, IS-6110) değeri tespit primerler kullanılır. Ayrıca DNA ekstraksiyonu herhangi bir başka uygun yöntem ile saf kültürler ve klinik (hastanın balgam) dan gerçekleştirilebilir. Örneğin, parçalama tamponu, taşıyıcı DNA olarak guanidin tiyosiyanat ve silis göre orada Bum yöntemi kullanıldığı zaman. her yıl artış zayıf bakteriyolojik farklıdır ve bu nedenle klinik uygulamada organizasyon tamamen farklı bir seviyede kurdu hasta sayısı: DNA okuyan moleküler genetik yöntem tanısında önemli bir rol oynamaktadır.

Ancak, bu sakıncaları olmadan olmadığını itiraf etmeliyim. PCR yöntemi genellikle kullanımı yanlış pozitif sonuçların çok sayıda getiriyor, ve neden sadece teknik hatalar, aynı zamanda yöntemin kendisinin özellikleri olduğunu. Buna ek olarak, tespit edilmiştir mikobakteri, canlılığını belirlemek için teşhis için bu yöntemi kullanarak, bu imkansızdır. Ama bu dezavantajı en önemli değildir. PCR tanı moleküler genetik yöntemler mikobakteri DNA kontaminasyon risk taşımaktadır. Bu nedenle sertifikasyon şartlarını PCR laboratuarlar için özel sert tasarlanmış, onlar üç ayrı binaları gerektirir. PCR teknolojisi uygun ekipman ve yüksek eğitimli personel kullanılmasını gerektirir, modern ve çok karmaşıktır.

bacterioscopy

analizin tanı sonuçları diğer verilerle karşılaştırılması gerekir Ne zaman: Klinik muayene, radyografi, smear mikroskop, kırpma ve belirli bir tedaviye bile tepki çok önemlidir. Bu seride, PCR çalışmaları sadece bileşenlerden biridir. bakteriyolojik - En basit ve en hızlı yöntemler olabilir erken teşhisinde patojeni algıla.

bir hafif (Ziehl-NEELSEN boyama) mikroskop ve floresan (renklendirici fluorochromes) vardır kullanılır. avantajı sonuçların yayma hızıdır. Ancak dezavantajları haklı olarak düşük duyarlılığa sınırlı kapasite olarak kabul edilir. Bununla birlikte, bu yöntem, en ekonomik ve tüberkülozlu hasta tespit etmek için zemin olarak WHO tavsiye verilir. mikobakteriler bakteriyolojik yöntemin saptanması tahmini değeri ve yaklaşık kantitatif bakteriyel boşaltım sahiptir. Çok daha güvenli tüberkülozun moleküler genetik araştırma yöntemleri ile başa çıkmak için.

Kültürler

mikobakteri iyi algılama kültürel çalışmalardan tanır. yumurta ortam içine yapılır patolojik madde ekim: Mordovsky Finn II, LJ ve benzeri yer alır. in vitro ilaç ve mikobakteri bir dizi etkinliğinin dolaylı kanıtlar ve kolonilerine mikobakteri direnç Deneyler, araştırma kültürünün uygulanan yöntem ise. çoklu ortamda tutulur patolojik malzemenin mikobakteri aşılama izolasyonu yüzdesini arttırmak.

Çok sayıda kültür, patojen içeren hibe ve sıvıların ihtiyaçlarının karşılanması. Bu sistemde kullanılan ve otomatik ölçüm tipi Vantes büyümesi. Bitkileri yedi ila sekiz haftaya kadar süreyle inkübasyon tutulmalıdır. Bu zamana kadar büyüme yetersizliği ile ekin negatif olarak kabul edilebilir. TB son derece hassastır teşhis malzeme bulaştırmak kobaylar,: Mycobacterium tuberculosis algılamak için en etkili yol biyolojik örnekleri düşünün.

Bazı rakamlar

gizli enfeksiyon - PCR teşhis tarafından açılan bir araştırmanın ilginç alan, M. tüberküloz araştırmaktır. TB enfeksiyonunun Modern kavramı M. tuberculosis ile temas halinde olan yüz kişiden doksan olabilir iyi bulaşmış, ancak bunlardan sadece on aktif hastalık geliştiriliyor olduğunu göstermektedir. Diğerleri TB bağışıklığı var ve vakaların yüzde doksan nedeni enfeksiyon latent kalır. bir model Algılama bu moleküler genetik bir yöntem sağlamıştır.

Genetikçiler olan bitkileri patolojik madde negatiftir ve M. tuberculosis ile enfekte olmuş kişilerin yüzde sekseni, ancak hastalığın radyografik belirtileri ile akan olanların elli beş yüzde, PCR pozitif tepkiler alınan söylüyor. Negatif onların analizleri (mikroskopi ve kültür) sonuçlarıyla, PCR çalışmalarla riski olan hastaların teşhisinde yardımcı genetik tanı yöntemidir edildi ve subklinik enfeksiyon M. tuberculosis mevcuttu.

Modern araştırma

Griess reaktifi ile test mikobakteri nitrat redüktaz aktivitesi: Rusya Federasyonu ve bakteriyolojik laboratuarlar mutlak konsantrasyonları hızlandırılmış bir yöntemi kullanılır. Tüberküloza karşı merkezleri ilaç direncini belirlemek için izin veren bir yöntem kullanınız. mikobakteri radyometrik ve floresan muhasebe sistemi büyüme otomatik sıvı ortam içinde bu tohum. Böyle bir analiz hızla yapılır - up iki hafta.

Şu anda yeni yöntemler geliştirilmektedir: mikobakterilerin ilaç direnci genotip düzeyinde ölçülür. direnç genlerinin moleküler mekanizmalar ve ilgili çalışmalar, mikobakterilerin varlığını gösterir. Bu genler, belirli ilaçlara karşı direnç ile ilişkilidir. Örneğin, kasa genleri Inha için katG izoniazid, rpoB geninin dirençli - rifampisin 16SP RNA genlerinin ve rpsL - streptomisin, emb1 - etambutol, gyrA için - yani bir florokinolon ve.

mutasyonlar

Modern teşhis önemli DNA çalışmak için moleküler genetik düzeyde yöntemi artış ve tüm spektrum mutasyonların büyük ölçekli çalışmalar yapmak izin verdi. Şimdi en yaygın 516, 526 ve 531 kodonlarda mutasyonlar rpoB geni ve çeşitli ilaçlara direnç tespit biliyoruz. Orada sadece geleneksel yöntemlerle mikobakterilerin tiplemesi için yöntemlerin bütün aralığı -, biyokimyasal, biyolojik ve kültürel değil, aynı zamanda yaygın olarak modern moleküler genetik teknikler kullanmıştır. Zaten yeterli ve monojenik hastalıkların tespiti için doğru teşhis yöntemi sağlamaktır. Bunlar belirli bir genin tam alan DNA çalışmalara dayanmaktadır. Bu, genellikle karmaşık bir süreçtir, zaman alıcı ve pahalı fakat moleküler genetik analizi ile sağlanan veriler, çok daha doğru ve bilgilendirici diğer tüm analizlerin verileri daha uzundur.

Uzun DNA herhangi çekirdekli hücreler odnakova olduğunu organizmanın ömrü boyunca değişmez olduğu bilinmektedir ve bu mümkün ontogenezimizin herhangi bir aşamasında, vücudun kesinlikle tüm hücrelerin analizi almak yapar edilmiştir. Hasarlı gen tam ölçekli klinik hastalığa ilk belirtilerin ortaya çıkması, hem de sağlıklı heterozigot kişiler önce algılandı, ancak geninde mutasyon olan edilebilir. Moleküler genetik kalıtsal hastalık tanı yöntemleri olarak (doğrudan yaklaşım, bir DNA-teşhis) ortaya çıkarmak için, ve aynı zamanda yakından bozuk bir genin (örneğin, DNA teşhis dolaylı yaklaşımı) bağlantılıdır marker lokusuna DNA (genetik polimorfizm), aile hastalık ayrılmasını analizine izin verir. Doğrudan ya da dolaylı olarak - herhangi bir DNA teşhis insan DNA'sının bir kesinlikle belirlenen kısmının tanımlanması yöntemleri dayanmaktadır.

doğrudan yöntemler

DNA, teşhis Doğrudan yöntemler suçlu geni kalıtsal hastalık gibi iyi bilinen, bilinen durumlar ve bunun mutasyon tipleri. Örneğin, bir dizi hastalığın, uygun bir direkt yöntemler. Bu Huntington koresi (uzatma CTG-tekrarlar), fenilketonüri (R408W), kistik fibroz (delF508, majör mutasyonlar) ve benzerleri. direkt yöntemin en önemli avantajı tamamına sahip tanısal doğruluk ve ailenin geri kalanının DNA analizi yapmaya gerek yoktur. İlgili genindeki bir mutasyon tespit edilirse, tam olarak yükü ailenin geri kalanı için kalıtım, genotip tayini tanısı onaylamak sağlar.

direkt tanı diğer avantajı hastalıktan ölen yakınları ve ailelerinden kötü mutasyonların heterozigot taşıyıcı belirlediği düşünülmektedir. hastalıklar çekinik otozomal için bu özellikle doğrudur. direkt yöntemlerin dezavantajları da mevcuttur. Onları uygulamak için, tam olarak biliyoruz onun spektrumu ve mutasyonların anormal geni, ekson-intron yapısı lokalize gerekir. tüm gen hastalıkları bugün bu tür bilgileri almamış olmak. tek ve aynı gen kalıtsal hastalıkların gelişimine neden olur patolojik mutasyonun çok sayıda olabilir çünkü bilgisellik direkt yöntemler, tam olarak kabul edilemez.

dolaylı yöntemler

DNA, teşhis Dolaylı yöntemler zarar gen tespit değilse, diğer durumlarda, tüm kullanılan, ama sadece kromozomal veya satır tanı (gen kompleksi moleküler organizasyonu ya da büyük ölçüde, bir çok varsa eğer olur, sonucu vermeyecektir eğer patolojik mutasyonlar). Dolaylı yöntemler alel ailede polimorfik belirteçlerin segregasyon analizi yapıldı. Aynı kromozom bölgesine veya lokusunda bulunan Marker yakından hastalığa bağlı ve çıkarmalar veya eklemeleri, nokta ikameleri, tekrarlar temsil eder ve bunların polimorfizm blokta farklı hücre miktarı nedeniyle edilir.

yaygın insan genomunda dağıtılır dolaylı tanı olarak kabul mikrosatellit ve minisatelit polimorfizmleri, En uygun. markör ve gen arasındaki genetik mesafe için bir hasar çok büyük değilse, bunların bir değer, yüksek bilgi olarak ifade edilmiştir. Bu ikinci durumda, tahmin doğruluğu büyük ölçüde polimorfik marker ve zarar arasında rekombinasyon sıklığı tespit edilir. Dolaylı tanısal yöntemler aynı zamanda, zorunlu ön hasta ve mutasyonlar taşıyıcılar olarak analiz popülasyonu çalışmanın alel frekansları aşamasını artı dengesiz yapışma belirteçleri ve mutant alelleri rekombinasyonu olasılığını belirlemek gerekliliğini sağlar.

diğer yöntemler

mikroskopik muayeneye altında görüntülendi RNA veya DNA kısa parçalar, aynı zamanda, tek bir gen, bu nedenle, moleküler genetik tanı gerekli mutasyonları tespit etmek, olamaz. "İnsan Genomu Projesi", hem de moleküler genetik diğer gelişmeler bulunmaktadır ölçüde kalıtsal hastalıkların teşhisi olasılığını genişletilmiş - öncesi ve sonrası her iki. Bu yöntemler erken tespitini sağlayan ve kimin ilk yetişkinlikte gerçekleşen bir öngörü poli- ve tek gen hastalıkları, yapabilirsiniz. Ne yazık ki, moleküler genetik çalışmaların teknik yetenekleri nedeniyle tanı ergenlik ve çocukluk çağında olduğunu, özellikle bazen miras ile ilgili olarak ayarlanır etik sınırların ötesindedir.

Yapısal ve sayısal kromozom anormallikleri hastalığı ve kanser ve birçok malformasyonlar en sık nedenleridir. Kromozomal aile danışmanlığı için önemli olan, tespit edilmesi gereken - Gelecek gebelikler üreme riski ile birlikte tahminlerini değerlendirmek. Kromozom analizi genetik tanı "altın standart", ama sınırlıdır. Sadece yöntemleri moleküler genetik analizler klasik anlaşılması imkansızdır ince kromozom değişiklikleri belirlemek için kendi yüksek hassasiyet kapasitesine sahip teknoloji tabanlı floresan etiketleri klonlama orada kullanılan çünkü daha fazlasını yapabilirsiniz sitogenetik çalışmalar. Bu teknikler giderek bizim teşhis yetenekleri genişletiyoruz, incelendiğinde, diğer birçok kalıtsal hastalıklara sahip gelişimsel, zihinsel engelli, çocuklar.

bulgular

Bu gen yapısı ve bilginin fonksiyonu, değişkenlik türleri, moleküler genetik gelişimi ile bağlantılı olarak meydana gelen kalıtsal hastalıkların tespit yeteneği olan insanlar için çok önemlidir. yöntemlerini DNA molekülünün çalışma amaçlı - ve bunun normal ve hasarlı olduğunda. nükleotidler (DNA), deoksiribonükleik asit dizilerinin hazırlanması, bireysel fragmanlarının belirlenmesi için numune alma kademeli olarak uzanır. fragmanlarının genomik hücrelerden DNA, restriksiyon (yırtılma), amplifikasyon (klonlanması), elektroforez izolasyonu (agaroz jeli kendi elektrik yükünü ve moleküler ağırlık ayırma). ayrı bir şerit yüzeyinde bulunan özel fragmanlarının belirlenmesi.

Daha sonra klonlanmış DNA parçalarının veya sentetik radyoaktif problar ile her fragman hibridizasyon geçtiği hareket özel filtreler, içine alma, her bir test örneği eşit olacak kontrolüdür. Eğer mili ile karşılaştırılmıştır pozisyon veya uzunluğunu değiştirmek için, eğer yeni bir fragmanı veya yok - bu analiz geni nükleotid dizisinde yeniden yapılanmaya sahip olduğunu göstermektedir. Moleküler genetik çalışmalar sekiz temel teknik vardır: sekanslama (DNA dizisinin belirlenmesi), polimeraz zincir reaksiyonu (dizilerinin sayısındaki artış), primerler bilinen genlerin hazırlanması, DNA klonlama, rekombinant moleküller bağlı yeniden birleştirici molekül üretimi türetilmiş proteinler, tam bir kümesi oluşturmak (toplama kütüphane) sınırlama kullanılarak elde edilmiştir fragmanları klonlanmış.